TaKaRa Code：D103A®pMD 18-T Simple Vector说明书要点

Code ：D103A®pMD 18-T 说明书宝生物工程(大连)有限公司目 录内 容页 码 制品说明1 制品内容1 保存1 纯 度1 用 途1® pMD 18-T 的结构1 实验操作 DNA 片段的克隆实验2一般DNA 片段的克隆实验2一种可供选择的快速克隆法3 相关说明4 使用注意4 QA5制品说明® pMD 18-T 是一种高效克隆PCR产物（TA ）的专用载体。本载体由pUC18 载体改 建而成，它消除了pUC18 载体上的多克隆酶切位点，再在pUC18 载体的多克隆酶切位点处导入了EcoR V 酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的 3‘ 端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进 行PCR反应时都有在PCR 产物的3’ 末端添加一个“A”的特性 ，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的 连接、克隆效率。 本载体尽管消除了LacZ 基因上的多克隆酶切位点，但不影响β-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR 产物 克隆后仍可以利用α-互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性克隆。 由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR 扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用 PCR 扩增引物导入的酶切位点进行 DNA 酶切时，酶切 反应将不会受到T 载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功 率。 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC18 载体相同的功能。此外，本制品中的 高效连接液 I 可以在短时间内（约30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化， 大大方便了实验操作。本制品中的 （500 bp ）还可以用于 反应。 制品内容® pMD 18-T （50 ng/μl ）20 μl×1 支 （50 ng/μl ）10 μl×1 支 I*75 μl×2 支* * 使用时请于冰中融解。 保存： -20℃ 纯 度 克隆后的白色菌落中，有90%以上含有 DNA 片段。 用 途 进行TA 克隆，克隆PCR 产物。 对克隆后的PCR产物使用 、M13 进行DNA测序。® pMD 18-T 的结构®pMD 18- (2,692 bp)-1-®【pMD 18-T 相关位点说明】 M13-47 ~ RV-M ~ ~ ~~2492 实验操作 DNA 片段的克隆实验 A ）操作方法 1 ）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5 μl。试剂使用量®pMD 18-T *11 μ *21 μ μl 2 ）加入5 μl （等量）的 I。 3 ）16℃反应30 分钟。注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 4 ）全量（10 μl ）加入至100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置30 分钟。 5 ）42℃加热45 秒钟后，再在冰中放置1 分钟。 6 ）加入890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养60 分钟。 7 ）在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8 ）挑选白色菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 B ）结 果8 cfu/μg pUC19使用 时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.52×10DNA。连接/转化效率 白色菌落比率（% ） 效率（% ）*（cfu/μg ）＋1.8×10697.790 以上－1.2×10541.30* 效率是指白色菌落中的目的DNA 片段的插入效率。一般DNA 片段的克隆实验 1 ）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5 μl。试剂使用量®pMD 18-T *11 μ DNA*30.1 pmol ～0.3 to 5 μl 2 ）加入5 μl （等量）的 I。-2- 3 ）16℃反应30 分钟。注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③ 长片段PCR 产物（2 kbp 以上）进行DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 4 ）全量（10 μl ）加入至100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置30 分钟。 5 ）42℃加热45 秒钟后，再在冰中放置1 分钟。 6 ）加入890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养60 分钟。 7 ）在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8 ）挑选白色菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。一种可供选择的快速克隆法*4 1 ）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5 μl。试剂使用量®pMD 18-T *11 μ DNA*30.1 pmol ～0.3 to 5 μl 2 ）加入5 μl （等量）的 I。 3 ）16℃反应30 分钟。注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③ 长片段PCR 产物（2 kbp 以上）进行DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 4 ）取2 μl 上述连接液（10 ng DNA ）加入到 tubes 中，冰上冷却2 min。 5 ）取50 μl E.coli JM109 Cell 加入到上述 tubes 中，混匀并冰浴5 min。 6 ）在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在37℃预热30 分钟），形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。*1 pMD® 18-T 的使用量®取0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD 18- 1 μl （50 ng ）的摩尔数约为0.03 pmol。*2 为500 bp 的3′ 末端带有A 碱基的PCR 产物， 1 μl （50 ng ）的摩尔数约为0.15 pmol。*3 DNA 的使用量在进行克隆时， DNA 和 DNA 的摩尔比一般为：1 ：2 ～10。*4 快速克隆法该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆 DNA 片段的方法，可以满足一定客户的需求。-3- 相关说明 1. 感受态细胞的选择。转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19 ），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’ 编码的［ ］）产生 ω ，才可能和载体DNA产生的LacZ α多肽相结合，表现出 β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。 2. DNA 的要求。 DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用 凝胶回收试剂盒（ Code ：D301 或 ）。 3. DNA 使用量的计算方法。进行克隆时， DNA 和 DNA 的摩尔数比一般为1 ：2 ～10 ，我们可以根据自己的实验情况选择合适的 DNA 和 DNA 的摩尔数比。 DNA 使用量的计算方法如下： DNA 的使用量（ng ）=nmol 数×660× DNA 的bp 数本载体1 μl （50 ng ）的摩尔数约为0.03 pmol。 4. 阳性克隆的检测。DNA片段成功插入至pMD® 18-T 中后，一般情况下 β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用 ，可以对菌体直接进行PCR扩增。 5. 阳性对照实验。为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的 ，可以进行10 次阳性对照实验。 6. 转化效率的计算。取0.1 ng的pUC19 DNA加入至100 μl的热转化感受态细胞中后，再加入900 μl的SOC培养基（0.1 ng DNA/ml ），将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml ）取100 μl涂布平板（0.001 ng DNA/1005μl ），记录菌落数。以得到200 个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×10cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。 使用注意 1. 由于载体上的多克隆酶切位点被破坏，所以使用本载体克隆PCR 产物时，注意应在 PCR 引物上设计导入酶切位点，否则将会难以切下DNA 片段进行其它亚克隆实验。 2. I 请于冰中融解。 3. 克隆时使用的 DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR 产物中的短片段DNA （甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA 克隆效率。 4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA 后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸共沉

DNA 克隆 进行 PCR 反应 效率